Salah satu luaran yang diharapkan oleh seorang mahasiswa farmasi adalah mampu menganalisis bahan baku farmasi, makanan, dan bentuk sediaan obat-obatan. Berikut adalah beberapa metode analisis berdasarkan ilmu biokimia mengenai asam amino,dan protein .
Percobaan asam amino dan protein
1. Test Millon
Reaksi ini disebabkan oleh derivat-derivat monofenol seperti tirosin. Pereaksi yang digunakan adalah larutan ion merkuri/merkuro dalam asam nitrat/nitrit. Warna merah yang terbentuk mungkin disebabkan oleh garam merkuri dari tirosin yang ternitrasi.
Metode :
Tambahkan 5 tetes pereaksi Millon ke dalam tabung reaksi yang telah berisi 3 ml albumin, kasein, fenol 2% dan putih telur. Panaskan campuran dengan hati-hati. Warna merah menyatakan hasil positif, jika reagen yang digunakan terlalu banyak maka warna akan hilang dengan pemanasan.
| Larutan Uji | Sebelum dipanaskan | Setelah dipanaskan | Hasil Uji |
| Albumin | Ada yang menggumpal | Gumpalan merah | + |
| Kasein | Ada endapan | Gumpalan merah | + |
| Fenol 2% | Bening | Merah | + |
| Putih Telur | Ada yang menggumpal | Gumpalan merah | + |
Gambar 1. Test Millon (Kasein-Putih telur-Fenol 2%-Albumin)
Baik Albumin, kasein, fenol 2 %, maupun putih telur memberikan hasil (+) terhadap test Millon. Hal ini dikarenakan pada Albumin, Kasein, fenol 2% dan putih telur mengandung derivat monofenol.
Reaksi ini didasari bahwa bila suatu protein ditambahkan garam merkuri, maka akan terjadi koagulasi. Protein dapat terkoagulasi karena protein mengalami destruksi bentuk tiga dimensi dari rantai polipeptida yang ikatannya akan pecah tanpa mengakibatkan pemecahan ikatan kovalen dari ikatan peptidanya.
2. Test Hopkins-Cole
Pereaksi yang digunakan mengandung asam diglioksilat. Triptofan berkondensasi dengan aldehida, dan dengan asam pekat membentuk kompleks berwarna dari jenis asam 2,3,4,5-tetrahidro-karbolin-4-karboksilat.
Metode :
Campurlah 2 ml larutan albumin 2%, kasein, dan putih telur dengan larutan Hopkins-Cole. Tambahkan dengan hati-hati melalui dinding tabung asam sulfat pekat. Amati warna yang terbentuk pada pertemuan kedua cairan.
| Larutan uji | Warna | Hasil uji |
| Albumin 2 % | Ungu | + |
| Kasein | Ungu | + |
| Putih telur | Ungu | + |
Gambar 2. Test Hopkin-Cole (Kasein-Putih telur-Albumin 2%)
Pereaksi Hopkins-Cole terdiri dari asam glioksilat (CHO.COOH) dalam H2SO4 (p). Triptofan diduga berkondensasi dengan aldehida ini,dan dengan asam pekat membentuk kompleks berwarna dari jenis asam 2,3,4,5-tetrahidro-β-karbolin-4-karboksilat.
Test ini berhasil bila terdapat oksidator kuat seperti nitrat dan klorat. Asam sulfat yang digunakan harus sangat murni yang berarti tidak mengandung bahan-bahan yang bertindak sebagai oksidator.
Hasil positif (membentuk cincin ungu) diberikan oleh ketiga larutan uji, yaitu albumin, kasein, dan putih telur. Hasil tersebut menunjukkan bahwa dalam ketiga zat terdapat asam amino triptofan. Warna ungu diberikan oleh gugus indol yang terdapat dalam triptofan.
Reaksi dari test Hopkins-Cole yaitu:
3. Test Ninhidrin
Semua asam amino alfa bereaksi dengan ninhidrin membentuk aldehida dengan satu atom C lebih rendah dan melepaskan NH3 dan CO2. Disamping itu, terbentuk kompleks berwarna biru yang disebabkan oleh 2 molekul ninhidrin yang bereaksi dengan NH3 setelah asam amino tersebut dioksidasi. Garam-garam ammonium, amina, peptida, dan protein juga bereaksi tetapi tanpa melepaskan CO2 dan NH3.
Metode :
Dalam tabung reaksi yang berisi larutan (NH4)2SO4, albumin 2%, kasein 2%, dan putih telur ditambah 0,5 ml larutan Ninhidrin 0,1%. Letakkan pada pemanas air mendidih selama 10 menit.
| Larutan uji | Warna | Hasil Uji |
| (NH4)2SO4 | Bening | - |
| Albumin 2% | Biru | + |
| Kasein 0,2% | Endapan biru | + |
| Putih telur | Biru | + |
4. Test Biuret
Merupakan tes umum yang baik untuk protein. Warna yang terbentuk kemungkinan berasal dari kompleks antara ion Cu++ dengan gugus –CO dan –NH ikatan peptida dalam suatu alkalis.
Metode :
1. Campurlah 2 ml larutan albumin 2% dengan 2 ml NaOH 10% dan tambahkan setetes larutan CuSO4. Campurlah dengan baik, jika belum terbentuk warna tambahkan lagi setetes atau 2 tetes CuSO4. ulangi test ini dengan larutan kasein dan putih telur.
2. Isilah tabung reaksi dengan sedikit urea, panaskan di atas api kecil sehingga zat tersebut mencair dan terbentuk gelembung-gelembung gas (hati-hati jangan sampai mengarang) perhatikan bau gas yang terbentuk. Larutkan isi tabung tersebut dengan air dan lakukan test Biuret seperti di atas.
5. Test Xanthoprotein
Reaksi ini berdasarkan nitrasi inti benzen yang terdapat dalam molekul protein. Senyawa nitro yang terbentuk berwarna kuning dan dalam lingkungan alkalis ia terionisasi dengan bebas dan warnanya menjadi lebih tua atau menjadi jingga.
Metode :
Campurlah 2 ml larutan albumin 2% dengan 1 ml HNO3 pekat. Perhatikan terbentuknya endapan berwarna putih. Panaskan hati-hati, endapan akan larut kembali dan larutan tersebut akan berubah menjadi kuning. Dinginkan di bawah kran dan dengan hati-hati (tetes demi tetes) tambahkan dengan larutan alkali pekat (NaOH atau NH4OH). Ulangi percobaan larutan kasein, larutan fenol 2%, dan larutan putih telur.
6. Pengaruh Logam Berat
Metode :
Ke dalam 3 ml larutan albumin 2% da larutan putih telur ditambahkan 5 tetes larutan HgCl2 2%. Ulangi percobaan dengan menggunakan Pb-asetat 2% dan FeCl3 2%.
7. Koagulasi Protein dengan Pemanasan
Metode :
Isilah 2 tabung reaksi dengan 50 mg serbuk albumin. Tambahkan 5 ml air pada salah satu tabung. Letakkan kedua tabung pada pemanas air mendidih dengan sering-sering mengocoknya selama 15 menit, angkat keduanya, dinginkan dan tambahkan dengan 5 ml air pada tabung yang berisi albumin kering. Kocok keduanya lalu saring, pada filtrat lakukan test Biuret.
Dra. Azizahwati, Msi. Buku Penuntun Praktikum Biokimia. Laboratorium Biokimia Jurusan Farmasi FMIPA-UI. 1999: 1-6.
Murray RF; Granner OK; Rodwell V. Harper’s Review of Biochemistry Jakarta: Buku Kedokteran. 1995.
Tidak ada komentar:
Posting Komentar